GAMA RADYASYONUN MİKROORGANİZMALARA ETKİSİ, ÖLDÜRME KİNETİĞİ VE DOZ SEÇİMİ

 

Dr. Tülay KONAÇ

TAEK-ANTHAM- Gıda Işınlama ve Sterilizasyon Bölümü, Ankara

 

Radyasyonun Mikroorganizmalar Üzerine Etkisi

Günümüzde “Radyasyon Biyolojisi”; enerji absorbsiyonundan, ölüm veya hasarın ortaya çıkışına kadarki birçok adımı (sırasıyla fiziksel, fizikokimyasal, kimyasal ve biyolojik adım) açıklamaya çalışan oldukça kompleks bir bilim olarak karşımıza çıkmaktadır. Radyasyon hasarı oldukça erken fiziksel etkilerden, oldukça geç biyolojik etkilere kadar- kanser oluşumu gibi- geniş bir zaman diliminde gerçekleşebilir. Radyasyonun, direkt ve indirekt olmak üzere iki çeşit etki şekli söz konusudur. Direkt etkide hızla hareket eden yüklü parçacıklar biyolojik materyale veya moleküle çarptıklarında enerjilerini bunlara aktarırlar. Buda etkilenen materyalin biyolojik fonksiyonlarını değiştirmekte veya yok etmektedir. İndirekt etki ise suyun hidrolizi ile ortaya çıkan primer ve sekonder radikaller (H, OH., O2H, H2O2 ) reaktif, redüktan, oksidan ve karbon-karbon bağlarını açabilen ajanlar olarak etki etmektedir. Mikroorganizmaların radyasyonla inaktivasyonunda her iki etki şekli rol oynamakla birlikte, indirekt etkinin payı daha büyüktür.

 

İyonize radyasyonun sebep olduğu hücresel hasar üç kategoride toplanabilir:

1. Lethal hasar: Geri dönüşümsüz, tamir edilemez ve dolayısıyla hücreyi ölüme götüren hasarlar.

2. Subletal hasar: Normal şartlarda, ilave bir subletal hasar eklenmedikçe birkaç saat içerisinde tamir edilebilir.

3. Potansiyel letal hasar: Işınlama sonrası çevresel şartlar bu tip hasara sahip hücrelerin kaderini belirler.

Radyasyonun hücreleri etkilemesindeki mekanizmalar tam olarak anlaşılamamakla beraber aşağıda belirtilen etki şekilleri üzerinde durulmaktadır;

Bu faktörlerden en önemlisi, hücre için önemi ve fonksiyonları göz önüne alındığında kuşkusuz DNA molekülü üzerine olan etkisidir. Radyasyonun direkt ve indirekt etkisi ile DNA molekülü üzerinde oluşabilecek etkiler;

  1. Zincirlerden birinde veya her ikisinde kırılma olması

  2. Bazlarda kayıp veya zarar oluşması (mutasyon)

  3. DNA nın kendi içerisinde veya proteinlerle çapraz bağlar oluşturması

Mikroorganizmaların radyasyona karşı hassasiyetleri farklılık göstermektedir. D10 değeri, radyasyona karşı direncin bir ölçüsü olarak, gerek radyasyonla sterilizasyon ve gereksede çeşitli amaçlarda mikrobiyel yükün azaltılmasını ve patojenlerin eliminasyonunu amaçlayan radyasyon uygulama işlemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 1). Tanım olarak D10 değeri, saf bir popülasyonun başlangıç mikrobiyal yükünü bir logaritmik basamak azaltan, diğer bir deyişle %90 nını öldüren radyasyon dozudur. Işınlama dozunun çok geniş sınırlar içerisinde değişmemesi halinde D10 değeri değişmemekte, hatta tür için ayırt edici bir özellik olarak sabit kalmaktadır.

 

Şekil 1. D10 değeri

Mikroorganizmaların ışınlamaya karşı duyarlılık derecelerini etkileyen faktörlerden başlıcaları;

 

1. Mikroorganizmaların DNA büyüklüğü (hacmi):

DNA büyüklüğü, radyasyon direncini etkileyen temel faktörlerden biridir. Eğer hedef molekül DNA ise, DNA büyüdükçe radyasyon hassasiyeti artar. Virüsler en küçük nükleik asite sahip olmaları nedeniyle, en dirençli mikroorganizmalar olup D10 değerleri 10-50 kGy arasındadır.

2. Mikroorganizmaların değişik formları (vegatatif, sporlu-sporsuz):

Işınlamaya karşı bakteriler, virüslerden daha kompleks tepki gösterirler. Bakterilerin spor formlarının, vegatatif formlarına göre daha dirençli olduğu görülmektedir. Bunun başlıca nedenleri; su konsantrasyonunun düşük olması, sporun koruyucu etkisi ve yapısındaki bazı kimyasal substantların (S-S zengin dipikolinik asit) direnç sağlaması sayılabilir. Bakterilerle karşılaştırıldığında, fungusların ışınlamaya yanıtları ise, büyüme alışkanlıkları ile daha kompleks sitoloji- morfoloji ve hayat sikluslarının neticesindedir. Fungus sporlarının radyasyon hassasiyeti, genetik faktörlerden ve hatta sporun yapısından etkilenmektedir.

3. DNA tamir mekanizmasının etkinliği:

Bazı micrococci türleri (Micrococcus radiodurans ve Micrococcus radiophylus gibi) yüksek tamir kapasiteleri nedeniyle birçok sporlu bakteriye göre radyasyona daha dirençlidir.

4. Işınlama öncesi , sırası ve sonrası çevresel şartlar:

Oksijenin radyasyon hassasiyetini artırdığı tüm hücresel tiplerde ve hatta daha yüksek organizmalarda bile gösterilmiştir. Örneğin; anaerobik ve patojenik clostridium sporları, aerobik ve apatojen bacillus sporlarından daha dirençlidir. Su varlığında radyasyonun indirekt etkisinden dolayı hassasiyet artar. Bunun dışında; radikallerin hareketini olumsuz yönde etkilemesi nedeniyle donma ve kuruluk radyasyona direnç oluşturan diğer etmenlerdendir. Ayrıca düşük sıcaklıklarda enzimatik tamir mekanizması yavaş işlediği, yüksek sıcaklıklarda ise enzim inaktivasyonu olduğu için etkin bir tamir mekanizması söz konusu olamaz ve radyasyon hassasiyeti artar. pH değeri nötralden uzaklaştıkça radyasyon hassasiyeti artmaktadır.

5. Radyasyon hassasiyetini artırıcı veya azaltıcı kimyasal ajanların varlığı:

Son yıllarda radyasyonla indüklenen hücresel hasarı artırıcı veya azaltıcı inorganik veya organik kimyasallar bulunmuştur. Eletron çeken gruptaki kimyasallar radyasyona hassaslaştırıcı olarak rol oynarken, örneğin sülfidril bileşikler etkiyi azaltıcı rol oynamaktadır.

6.Radyasyonun niteliği:

Bazı radyasyon tipleri mikroorganizmaları öldürmekte daha etkindir. Bu durum, bu tip radyasyonların oluşturdukları iyonizasyonun daha yoğun olmasından kaynaklanmaktadır. Bununla beraber; Gama, X ve hızlandırılmış elektronların mikroorganizmalar üzerine etkileri yaklaşık olarak eşdeğer olarak bulunmuştur.

Tablo 1, çeşitli canlıların radyasyonla inaktivasyon dozlarını ve Şekil 2 ise, çeşitli mikroorganizmaların genel olarak radyosensivitelerini gösterir(D10) hayatta kalış eğrilerini vermektedir.

 

 

Tablo 1. Çeşitli organizmaların inaktivasyon doz aralıkları

Organizma Doz (kGy)

-Memelilerinde dahil olduğu 0.001-0.005

yüksek organizmalar

-Bitkilerde filizlenmenin inhibisyonu 0.01-0.1

-Böcekler 0.1-1

-Küf 1-10

-Sporsuz bakteriler 1-10

-Sporlu bakteriler 10-30

-Virüsler 10-50

-Enzimler 50-200

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 2. Mikroorganizmalar arasındaki radyasyon farklılıkları

 

Ölüm Kinetiği

Uygulanan radyasyonun dozuyla, ışınlanan canlı popülasyonun hayatta kalış fraksiyonunu gösteren eğrilere hayatta kalış (survival) eğrileri denmektedir. Bu eğriler; enzimler, transforme olan DNA, virusler, bakteriler, mayalar, memeli hücreleri ve çok hücreli sistemler için oluşturulmaktadır. Mikroorganizmalar söz konusu olduğunda genellikle 3 tip hayatta kalış eğrisi elde edilir; Exponansiyal, birleşik ve sigmoidal hayatta kalış eğrileri(Şekil 3).

Exponansiyal (Üstel) eğrilerde; hayatta kalan fraksiyonun logaritması radyasyon dozuna doğrudan bağımlıdır ve her organizmada inaktivasyon için sadece bir hedef ve bu hedefe tek etkileşim (vuruş) gerektiğini gösterir (A). Exponansiyal eğriler için verilen eşitlik;

S’ = e-kD

Bileşik eğrilerde; farklı eksponansiyel doz-etki eğrileri olan iki veya daha fazla alt populasyonun bileşimini içerir (B). En basit şekilde a ve b populasyonlarını içeren karışımın hayatta kalış eğrisini veren eşitlik;

S’ = ae-kD + be-kD

Sigmoidal eğriler ise; her bir organizmanın inaktivasyon için birden fazla vuruşa (tek hedef-çok etkileşim) ihtiyaç olduğunu gösterir.şük doz aralıklarında bir omuz(shoulder) gözlenir, fakat yüksek dozlarda doza lineer olarak bağımlıdır. İnaktivasyon için birden fazla hedefin en az bir etkileşim görmesi gereken durumlarda da bu tip eğriler elde edilir(çok hedef-tek etkileşim). Sigmoidal eğriyi veren eşitlik(C);

S’ = 1- (1- ek nD)n

(S’= tek etkileşimden sonra hayatta kalan fraksiyon (S/S0), D= absorblanmış doz, k = elde edilen eğrinin eğimi, n= ekstrapolasyon sabitidir - eğrinin lineer kısmı logaritmik survival eksenle kesişmek üzere uzatılır ve kesişim noktası n olarak okunur)

Şekil 3. Hayatta kalış eğrileri

 

 

 

Radyasyonla sterilizasyon dozunun belirlenmesi

Temel varsayım, sterilize edilecek ürünün GMP (iyi üretim şartları) koşullarında üretilmiş olmasıdır. Buna göre, radyasyonla sterilize edilecek ürün üzerinde, mikrobiyal yükün düşük olmasını garantileyecek uygulama ve faaliyetlerin yerine getirilmesi oldukça önemlidir.

25 kGy’ lik (2.5 Mrad) bir doz etkili bir sterilizasyon dozu olarak belirlenmiştir. Genel kabul, bu dozun maksimum 10-6 lık bir sterilite temin seviyesi (SAL) sağladığı yönündedir. Ürün üzerinde doğal mikrobial yükün radyasyon direnci hakkında tespit edilmiş herhangi bir veri yoksa, geçerliliği gösterilmek şartıyla, minimum sterilizasyon dozu 25 kGy olarak alınabilir.

Sterilizasyon dozunun, istenilen SAL ve ürün mikrobial yükünün radyasyon direncine bağlı olarak seçimi birçok yönden daha akılcıdır. Bu yaklaşımın kullanıldığı doz seçim yöntemleri; AAMI*(Association for The Advancement of Medical İnstrumentation)’ın “ Tıbbi Ürünlerin Gama Radyasyonla Sterilizasyonu İşlem ve Kontrol Rehberi” nin Ek-B’sinde yer alan 2 doz seçim metodu (B1 ve B2) ve dozun geçerliliğini test eden doz kontrol (B5) metodudur. Bu metodlar, ürünün son kullanımı göz önüne alınarak belirlenmiş bir sterilite temin seviyesi için, sterilizasyon dozunun saptanmasında kullanılır. SAL, tek kullanımlık tıbbi ürünler için 10-3 –10-6 arasında bir değerdedir. Doz seçim yöntemlerinin uygulanması için temel gereksinimler şunlardır:

 

 

TAEK-ANTHAM-GISB-Deneysel amaçlı gama kaynağı

 

-1.0 – 18 kGy (0.1-1.8 Mrad)’ lık aralıkta doz verme kapasitesinde bir Co-60 radyasyon kaynağı.

- Yeterli bir mikrobiyoloji laboratuvarı.

- Esas imalatçı tarafından belirlenmiş bir sıklıkta, sterilizasyon dozunun geçerliliğinin kontrol edilmesi (B5 yöntemi).

 

Bütün metodlarda, sterilizasyon dozu, son sterilizasyon dozundan daha düşük doz (10-2 lik SAL sağlayan sınama dozu) almış örneklerin sterilite testi kullanılarak tespit edilir.

Doz seçimine B1 metodu ile başlanır, doz tespit edilemezse B2 ye geçilir. B1 metodunda ürün üzerindeki mikrobiyal yükün (bioburden) sayısı, B2 metodunda ise bu yükün radyasyon direnci ile ilgili bilgiler kullanılır. Doz bir kere belirlendikten sonra, geçerliliği belirli aralıklarla (3 ayda bir olması tavsiye edilir) B5 metodu uygulanarak kontrol edilir. B5 metodu sonunda ya dozun devamına, ya artırımına yada yeniden doz tespitine karar verilir.

 

Kaynaklar:

1-TAEK- ANTHAM-GISB, “Endüstride Radyasyonla Sterilizasyon” Kurs Kitabı, 21-25 Ekim 2002, Ankara.

2-L.G. Gazso, “Fundamentals of radiation microbiology”, National training course on industrial radiation sterilization, 2-13 Kasım 1992, Ankara.

3-J.L.Whitby,”Microbiological aspects relating to the choice of radiation sterilization dose”, Radiat.Phys.Chem.Vol.42,4-6pp.577-580,1993.

4-G.P.Jacobs, “Mechanism of radiation damage, National training course on industrial radiation sterilization,Haziran-1991,Ankara.

5-Process Control Guidelines for Gamma Radiation Sterilization of Medical Devices, AAMI RS-3/84